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產品FAQ

RT-PCR常見問題解答

发布时间:2019-05-15 11:20:19 点击次数:

Q:RNase H活性對反轉錄反應的影響?

A:RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA 雜交體中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一鏈cDNA 合成反應中DNA/RNA 雜交體中模板RNA被降解,從而保證第一鏈cDNA 的合成量和長度。


Q:不同溫度下的反轉錄反應有何差別?

A:一般的反轉錄酶的適宜反應溫度是42℃,但是對於某些GC含量高的基因或二級結構複雜的基因,在42℃不足以打開二級結構,使cDNA合成無法順利進行。此時需要用耐高溫的反轉錄酶,如TransScript ® II RT或TransScript ®-Uni RT,在高溫 (≤55℃或≤65℃)條件下進行反轉錄以獲得較好的結果。


Q:RT-PCR後,無PCR產物的原因?

A:在反轉錄反應前一定要電泳驗證RNA的完整性,確認RNA沒有降解。RNA不要保存時間過長,儘快進行反轉錄及PCR操作。


Q:基因克隆測序後經常發生突變的原因?

A:從cDNA進行基因克隆時,突變有可能發生在反轉錄過程,也可能發生在PCR過程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶進行擴增,循環數不要太高;可通過增加模板量、減少循環數降低突變機率。爲保證反轉錄時的保真性,請選擇保真性高的反轉錄酶。


Q:RT-PCR時模板一般使用多少?

A:反轉錄反應體系爲20μl時,用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA進行反轉錄,RT-PCR用1/20-1/10 PCR體積 (2.5-5μl) 的反轉錄產物作爲PCR模板 (50μl反應體系)


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