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產品FAQ

途游炸金花常見問題解答

发布时间:2019-05-15 11:07:25 点击次数:

Q: 擴增效率低:條帶較弱或無擴增

A:

• 酶的原因:實驗表明,途游炸金花酶對於DNA具有一定的偏好性。如使用一種酶經過優化難以獲得理想擴增時,可以嘗試其它途游炸金花酶。

• 模板引物的原因:確保模板、引物的品質,保證沒有降解。另外,如果模板含有較多的抑制物時(如植物基因組模板),推薦使用抗抑制能力強的途游炸金花酶;還可以對模板進行梯度稀釋後擴增,摸索合適的模板用量。

• 反應體系與條件的原因:增加循環數、降低退火溫溼度、適當提高Mg2+工作濃度,都可以提高擴增效率,但同時會導致特異性與保真性下降,需要根據具體的實驗要求優化合適的條件。


Q: 擴增特異性差:引物二聚體、雜帶、拖尾等

A:

• 選擇熱啓動酶:與普通途游炸金花酶相比,熱啓動酶具有更高的擴增效率和特異性。

• 優化反應體系與條件:升高退火溫度可以有效提高特異性。另外減少循環數、適當降低Mg2+工作濃度,也可以提高特異性,但都會導致擴增效率的下降,需要根據具體的實驗要求優化合適的條件。還可以嘗試某些特殊的程序,如巢式途游炸金花、Touch         Down 途游炸金花等。

• 途游炸金花產物需要進行後續實驗時,如果確定有目的條帶擴增,可以凝膠回收目的條帶。


Q:擴增保真性差:突變、插入、缺失等

A:

• 選擇高保真酶:B型DNA聚合酶,如Pfu系列酶,具有3』-5』的外切酶活性,能夠校正錯配的鹼基,具有高保真性。另外,複合酶中由於有B型DNA聚合酶的存在,也具有較高的保真性,但保真性比B型DNA聚合酶要低。

• 優化途游炸金花體系與條件:適當增加模板量、減少循環數,可以降低突變機率,提高保真性。

確認保真性低的原因:有時保真性低並非由途游炸金花引起,途游炸金花通常只會導致數量很少的單鹼基突變。如果產物測序後,發現大量的突變,或有明顯的插入、缺失等,很可能是來自其它實驗步驟,如DNA在大腸桿菌中複製是發生重組,或是測序時的汙染。這種情況,可以重新反轉錄或選保真性更高的反轉錄酶。


Q:Pfu酶擴增如何加「A」?

A:

• 在10 µl體系中,加入純化後途游炸金花產物、0.2 µl Taq DNA Polymerase、0.5 µl 10 mM dNTP (或0.5 µl 2.5 mM dATP)、1 µl 10xTaq Buffer, 72℃ 反應10-15分鐘即可。


Q:出現假陽性擴增

A:

• 引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行途游炸金花擴增時,擴增出的途游炸金花產物爲非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

• 靶序列或擴增產物的交叉汙染:一是整個基因組或大片段的交叉汙染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補後,可擴增出途游炸金花產物,而導致假陽性的產生,可用巢式途游炸金花方法來減輕或消除。




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